Practicum CRISPR/Cas9

Opdracht 1

Zou jij liever blind of doof zijn? Leg uit waarom.

Opdracht 2

Aangezien het Usher syndroom een zeldzame ziekte is, erft deze waarschijnlijk recessief/ dominant over.

Opdracht 3

Hoe kunnen beschadigde staafjes ervoor zorgen dat patiënten ’s nachts slecht kunnen zien?

Opdracht 4

Waar staan de afkortingen CRISPR en Cas9 voor?

Opdracht 5

Wat betekent het dat het crRNA een sequentie bevat die complementair is aan een bepaald virus?

Opdracht 6

Wat is de verbetering die wetenschappers Doudna en Charpentier hebben aangebracht in het originele CRISPR/Cas9 systeem?

Opdracht 7

a. Koppel de termen aan het juiste cijfer: guide RNA, PAM-volgorde, dubbelstrengs DNA, overeenkomende DNA-volgorde, Cas9

b. Waarom is de PAM-volgorde belangrijk?

Opdracht 8

Leg in je eigen woorden kort uit hoe CRISPR/Cas9 werkt.

volgende opdracht ->

Model voor Usher syndroom type 2a in de zebravis

Om een therapie te vinden voor de blindheid in het Usher syndroom, maken wetenschappers eerst een model voor deze ziekte in een modelorganisme. Er bestaan verschillende modelorganismen, zoals de muis, rat, fruitvlieg en zebravis. Ook al is het misschien niet je eerste logische gedachte, is het toch dit laatste modelorganisme wat wordt gekozen om een model te maken van het Ushersyndroom. 

Eerst gaan we checken of we de zebravis inderdaad als modelorganisme kunnen gebruiken, door te controleren of deze over de juiste genetische informatie beschikt. Dit doen we met behulp van de UCSC Genome Browser.

Kies linksboven voor de optie ‘Genomes’. Kies vervolgens voor de sort ‘Zebrafish’ en vul bij het zoekveld gemarkeerd met de pijl in onderstaande afbeelding ‘USH2A’ in. Klik vervolgens op ‘GO’. 

 Je komt als het goed is op onderstaand scherm uit. Klik op de optie die gemarkeerd is met de rode pijl.

Opdracht 9

a. Heeft de zebravis een USH2A gen?

b. Zo ja, op welk chromosoom ligt dit gen?

Opdracht 10

a. Kun je nog een organisme vinden met een USH2A gen? Zo ja, welke?

b. Op welk chromosoom ligt het gen bij dit organisme?

<- vorige opdracht                                   volgende opdracht -> 

Eiwit-trunkerende mutatie van het USH2A gen

In exon 13 van het USH2A gen zit een deletie. 

Opdracht 11

Leg uit wat het algemene effect is van een mutatie waarbij een vroegtijd stopcodon ontstaat en waarom?

Klik nu op de plek die rood omcirkeld staat in onderstaande afbeelding. 

Klik vervolgens hier:

Opdracht 12

Je ziet nu de cDNA-volgorde van het Ush2a gen. cDNA is DNA dat door reverse-transcriptie uit mRNA is verkregen. Dat betekent dat het RNA is gekopieerd naar een DNA-volgorde.

a. Wat is cDNA?

b. Welk gedeelte van het RNA is niet aanwezig in cDNA?

c. Waarom denk je dat bepaalde gedeelte rood en andere gedeeltes blauw zijn? Leg uit met behulp van de codontabel.

Opdracht 13

Het is bekend dat de meestvoorkomende mutatie in het USH2A gen in exon 13 zit. Op positie 132 van dit exon is een deletie van de base G. Klik links in het menu op ‘block13’. Je gaat dan naar de volgorde van exon 13. 

a. Markeer hieronder de gemuteerde base (tip: ieder blok bestaat uit 10 basen).

b. Waarom begint deze volgorde niet met een start- en een stopcodon?

<- vorige opdracht                                   volgende opdracht -> 

Het ontwerpen van een sgRNA

Opdracht 14

Waarom maken de onderzoekers een model voor het Usher syndroom in de zebravis?

Opdracht 15

Welke CRISPR/Cas reparatiemethode gebruik je voor het aanbrengen van de gewenste mutatie? Zie de afbeelding hieronder voor een herhaling van de twee reparatie opties die bestaan.

 

Open de website CRISPRscan. Kies in het menu bovenin voor de optie ‘Submit sequence’. Kopieer de DNA-volgorde van exon 13 van het USH2A gen en plak het in de website. Zorg ervoor dat de overige instellingen zoals hieronder staan en klik op ‘Get sgRNAs’. 

Opdracht 16

Zoek de beste sgRNA door een sgRNA te kiezen wat zo dichtbij en nauwkeurig mogelijk de locatie van de deletie knipt. 

a. Welke guide RNA kies jij?

b. Wat is de PAM-volgorde van de door jouw gekozen guide RNA?

We bestellen de net ontworpen guide RNA en een Cas9 eiwit. Nu gaan we het zebravis model maken:

• We injecteren de guide RNA en het Cas9 eiwit als kant-en-klaar complex in bevruchte eieren van de zebravis
• We kruisen de vissen totdat we homozygote mutanten krijgen

Opdracht 17

Waarom is het belangrijk dat we homozygoot mutante zebravissen hebben?

Opdracht 18

Als we heterozygoot mutante zebravissen hebben, hoeveel van de nakomelingen verwacht je dan de homozygote mutatie te hebben?

Opdracht 19

Noem twee voor- en twee nadelen van het gebruik van CRISPR/Cas9. Denk ook aan bijvoorbeeld ethische bezwaren. 

<- vorige opdracht

Gefeliciteerd!

Nu hebben we aan alles gedacht om een Functioneel zebravis model te krijgen voor de recessieve mutatie in exon 13 van het Ush2a gen.

Zou je het evaluatieformulier willen invullen? Zo kunnen we het practicum in de toekomst nog leuker maken en bovendien maak jij kans om een Radboud Hoodie te winnen!