Radboud Universiteit
Als lid van het CSI-genomics team ben je opgeroepen om te assisteren op een plaats delict: er is een lijk van een Amerikaanse toerist gevonden op het vliegveld. Hij ligt op de grond en er is niet direct iets te zien wat met zijn dood te maken kan hebben: geen slag- of steekwonden. Naast hem is een pakje gevonden waaruit hij blijkbaar gedronken heeft, met daarin nog een restje vloeistof.
De vloeistof gaat naar het lab en je krijgt een lijstje terug van stoffen die erin zitten. Naast een aantal kleine moleculen, zoals suikers en vetten, is een viertal verschillende eiwitten gevonden. Je krijgt de opdracht van het rechercheteam om deze eiwitten verder te gaan onderzoeken om te kijken of je aanwijzingen kunt vinden voor de dood van de Amerikaan.
Ga naar: Opdracht 1 | Opdracht 2 t/m 5 | Opdracht 6 t/m 11 | Opdracht 12 & 13 | Opdracht 14 & 15
Voor de identificatie van de eiwitten wordt het zoekprogramma BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) gebruikt. BLAST is een programma waarmee je een aminozuursequentie kunt vergelijken met alle aminozuursequenties in de database SwissProt. Deze database bevat alle aminozuursequenties die de wetenschap op dit moment kent. Om kennis te maken met BLAST wordt het eerste eiwit met behulp van een stappenplan voorgedaan. Daarna kun je de stappen voor de andere eiwitten zelf uitvoeren om uit te zoeken welk van de vier schuldig is.
Instructie MRS
Open MRS in je browser. Met behulp van screenshots gaan we samen het eerste eiwit onderzoeken. Daarna ga je zelf aan de slag om de andere verdachte eiwitten te analyseren.
Het beginscherm ziet er als volgt uit:
Kies 'BLAST' in het menu (links boven).
Je start hiermee het programma BLAST. Je ziet hieronder het voorbeeldscherm met daarin de aminozuursequentie van het eerste eiwit. De eerste regel moet altijd beginnen met een > met daarachter de naam van het eiwit (dit is het zogenaamde FASTA formaat). Hier is gekozen voor de naam kandidaat1.
Dit is de aminozuurvolgorde van het eerste verdachte eiwit (deze staat al in een FASTA formaat):
>kandidaat1
RPKHPIKHQG LPQEVLNENL LRFFVAPFPE VFGKEKVNEL SKDIGSESTE DQAMEDIKQM EAESISSSEE IVPNSVEQKH IQKEDVPSER YLGYLEQLLR LKKYKVPQLE IVPNSAEERL HSMKEGIHAQ QKEPMIGVNQ ELAYFYPELF RQFYQLDAYP SGAWYYVPLG TQYTDAPSFS DIPNPIGSEN SEKTTMPLW
Je komt nu in het volgende scherm, waar running komt te staan terwijl BLAST bezig is. Als je met veel computers tegelijkertijd bezig bent kan dit eventjes duren (maximaal 5 minuten). Je bent tenslotte een database met honderdduizenden eiwitsequenties aan het doorzoeken!
Als de zoektocht klaar is verschijnt er een balkje met resultaten dat lijkt op hetgeen hieronder is weergegeven (de getallen kunnen veranderen na updates van SwissProt):
Deze output betekent dat er 158 hits zijn gevonden in de database SwissProt. Dat wil zeggen, er zijn 158 eiwitten gevonden waarvan de aminozuurvolgorde lijkt op die van kandidaat1. Hoe hoger het percentage identiteit en hoe kleiner de E‑value, hoe betrouwbaarder het resultaat. Let op: de cijfers die je krijgt kunnen anders zijn dan de getallen uit de screenshots, aangezien de databases constant up-to-date worden gehouden.
Klik nu de regel aan om verder in detail naar de gevonden resultaten te kijken. Het volgende scherm verschijnt:
Dit is de lijst van aminozuurvolgordes die gevonden zijn in de databank.
Van links naar rechts lees je op elke regel de eigenschappen van een hit:
Klik op het gekleurde balkje en daarna nog een keer op het tweekleurige balkje. Bekijk de gegevens.
Dit is een zogenaamde alignment van twee aminozuurvolgordes. Q (query) is de volgorde van jouw zoekopdracht, in dit geval kandidaat1. S is de aminozuurvolgorde uit de database, in dit geval CASA1_BOVIN. De regel tussen de 2 volgordes bevat de letters van de identieke aminozuren tussen Q en S. Als niet alle aminozuren hetzelfde zijn tussen Q en S zie je hier gaten vallen.
Je kunt zien dat de volgorde van kandidaat1 voor 100% overeenkomt met de volgorde van CASA1_BOVIN (alle 199 aminozuren zijn identiek). Je kunt nu met zekerheid zeggen dat jouw ingevoerde aminozuurvolgorde casa1_bovin is!
Klik op CASA1_BOVIN om te kijken wat in de database nog meer vermeld staat over dit eiwit.
Het informatiescherm over het eiwit heb je nodig om onderstaande vragen te beantwoorden. Vul nu de antwoorden voor kandidaat 1 op het antwoordblad.
Onderzoek de andere drie eiwitten door hetzelfde stappenplan als voor kandidaat 1 te volgen. Vul je antwoorden in op het invulformulier. De aminozuurvolgordes van de eiwitten kun je hieronder vinden.
Let op: kopieer de eiwitten één voor één naar het programma MRS!
Lijst aminozuursequenties van de 4 verdachte eiwitten
Let op: De aminozuursequenties worden gegeven in 1-lettercode, dit is de notatie die wetenschappers gebruiken. Als je die code niet meer weet, gebruik dan onderstaand geheugensteuntje.
>kandidaat1
RPKHPIKHQG LPQEVLNENL LRFFVAPFPE VFGKEKVNEL SKDIGSESTE DQAMEDIKQM
EAESISSSEE IVPNSVEQKH IQKEDVPSER YLGYLEQLLR LKKYKVPQLE IVPNSAEERL
HSMKEGIHAQ QKEPMIGVNQ ELAYFYPELF RQFYQLDAYP SGAWYYVPLG TQYTDAPSFS
DIPNPIGSEN SEKTTMPLW
>kandidaat2
QYSSNTQQGR TSIVHLFEWR WVDIALECER YLAPKGFGGV QVSPPNENVA IHNPFRPWWE
RYQPVSYKLC TRSGNEDEFR NMVTRCNNVG VRIYVDAVIN HMCGNAVSAG TSSTCGSYFN
PGSRDFPAVP YSGWDFNDGK CKTGSGDIEN YNDATQVRDC RLSGLLDLAL GKDYVRSKIA
EYMNHLIDIG VAGFRIDASK HMWPGDIKAI LDKLHNLNSN WFPEGSKPFI YQEVIDLGGE
PIKSSDYFGN GRVTEFKYGA KLGTVIRKWN GEKMSYLKNW GEGWGFMPSD RALVFVDNHD
NQRGHGAGGA SILTFWDARL YKMAVGFMLA HPYGFTRVMS SYRWPRYFEN GKDVNDWVGP
PNDNGVTKEV TINPDTTCGN DWVCEHRWRQ IRNMVNFRNV VDGQPFTNWY DNGSNQVAFG
RGNRGFIVFN NDDWTFSLTL QTGLPAGTYC DVISGDKING NCTGIKIYVS DDGKAHFSIS
NSAEDPFIAI HAESKL
>kandidaat3
QQNLPQRYIE LVVVADHRVF MKYNSDLNTI RTRVHEIVNF INGFYRSLNI HVSLTDLEIW
SNEDQINIQS ASSDTLNAFA EWRETDLLNR KSHDNAQLLT AIELDEETLG LAPLGTMCDP
KLSIGIVQDH SPINLLMGVT MAHELGHNLG MEHDGKDCLR GASLCIMRPG LTKGRSYEFS
DDSMHYYERF LKQYKPQCIL NKP
>kandidaat4
LIVTQTMKGL DIQKVAGTWY SLAMAASDIS LLDAQSAPLR VYVEELKPTP EGDLEILLQK
WENGECAQKK IIAEKTKIPA VFKIDALNEN KVLVLDTDYK KYLLFCMENS AEPEQSLACQ
CLVRTPEVDD EALEKFDKAL KALPMHIRLS FNPTQLEEQC HI
Eindconclusie
Wat is nu je conclusie over de doodsoorzaak van de man? Welk biologisch proces in het lichaam van de man heeft uiteindelijk gezorgd voor zijn overlijden?
Nader onderzoek
Je hebt in dit eerste practicumdeel veel geleerd over bioinformatica, namelijk over de analyse van aminozuurvolgordes met behulp van bioinformaticatools en -databanken.
Als iedereen klaar is gaan we jullie bevindingen bespreken en daarna door met het volgende onderdeel. In het tweede practicumdeel gaan we kijken naar structuren van eiwitten om zo hopelijk een tegengif te vinden voor het gevaarlijke eiwit!
Deze slangensoort zorgt voor het grootste aantal doden per jaar in de VS. Het gif, een metalloproteïnase, is een enzym dat de beschermlaag van bloedvaten afbreekt, waardoor het slachtoffer zeer ernstige inwendige bloedingen krijgt. Vanwege deze, voor de slachtoffers dodelijke, eigenschap is er een grote vraag naar een geschikt tegengif.
In dit practicum gaan we een tegengif ontwerpen door de ruimtelijke structuur van het atrolysine te bestuderen. Deze 3D structuur is van groot belang voor de werking van het eiwit.
Sommige aminozuren zijn in het eiwit belangrijker dan andere. Hoe zou je door middel van mutaties in het DNA kunnen onderzoeken of een aminozuur belangrijk is voor de functie van het eiwit? Gebruik in je antwoord de woorden 'vouwing' en 'actief centrum'.
Werken met Yasara
Yasara is een programma om eiwitmoleculen te bekijken en te manipuleren. Het is grotendeels in Nederland ontwikkeld door Elmar Krieger. Als Yasara nog niet op je computer is geïnstalleerd, kun je aan een student vragen hoe dat moet.
Zometeen laad je een klein ‘oefeneiwit’ in Yasara om het programma goed te begrijpen. De aminozuurvolgorde van dit eiwit is Asp-His-Arg-Gly-Gly-Met-Lys-Tyr. De 2D weergave zie je hieronder:
Start Yasara. Nadat Yasara geladen is, kan het eiwit worden ingeladen via het menu aan de linkerbovenkant van het venster: File > Load > YASARA scene. Kies het bestand introduction.sce en klik op OK.
Je ziet nu de structuur in de zogenaamde Ball and stick weergave. Dit houdt in dat je de individuele atomen en de bindingen daartussen kunt zien. Let op: de waterstofatomen worden niet weergegeven. Om het eiwitje heen is een zogenaamd Van-der-Waalsoppervlak getekend. Dit geeft aan hoeveel ruimte de atomen werkelijk innemen.
Als je de muisaanwijzer in het onderste gedeelte van het Yasarascherm houdt, verschijnt de zogenaamde aminozuurvolgordebalk. Hierin staan de aminozuren van het eiwit. Met de knop in de linker bovenhoek van de balk (die er uitziet als een blauwe punaise) zet je de balk vast.
Als je op een aminozuur in de balk klikt, gaat het Cα-atoom van dat aminozuur knipperen. Als je de Ctrl-toets inhoudt terwijl je klikt wordt je naar de juiste plaats in het eiwit gebracht. Met de muis kun je het eiwit bewegen (probeer maar) door de muisknop in te houden:
De atomen zijn gekleurd naar elementen (bijvoorbeeld koolstof of zuurstof). Als je op een atoom klikt krijg je in het tekstveld aan de linkerkant van het venster extra informatie.
In deze weergave zijn chemische (covalente) bindingen aangegeven als korte stokjes van een bepaalde kleur. Wat is het verschil is tussen de gele en de witte bindingen?
In de 3D structuur zijn drie soorten interacties tussen atomen weergegeven. Schematisch zien die interacties er zo uit:
In Yasara worden deze interacties weergegeven als lange staafjes in de kleuren groen, blauw en oranje.
Als je voorgaande opgaven hebt gemaakt, ben je klaar voor het echte werk.
Reset Yasara door File > New te kiezen en dan op Yes te klikken. Laad nu het bestand slangengif.pdb via File > Load > PDB file.
Je ziet nu het gif in de Ball weergave, je kunt alle atomen (behalve waterstof) zien. Er zijn ook andere manieren om naar het eiwit te kijken. Deze kun je zien met de functietoetsen F1 tot en met F8 op je toetsenbord:
F1: Ball-weergave (individuele atomen)
F2: Ball and stick-weergave (individuele atomen + bindingen)
F3: Stick-weergave (atomen zien eruit als stokjes)
F4: Cα-trace (alleen de Cα-atomen worden weergegeven, verbonden met stokjes)
F5: Backbone-trace (je ziet hoe de ruggengraat van peptideverbindingen gevouwen is)
F6: Cartoon-weergave (secundaire structuurelementen)
F7: Alternatieve cartoon-weergave
F8: Hiermee worden de zijketens (de R-groepen van een aminozuur) aan- of uitgezet
Met F5, F6 en F7 kun je in een oogopslag de secundaire structuurelementen herkennen. Welke secundaire structuren horen bij de blauwe en rode delen van het eiwit?
Een eiwit kan verschillende structuurelementen hebben. Probeer de volgende structuren te vinden: (Zoek maximaal 2 minuten per onderdeel.) Gebruik hierbij de verschillende weergaves om het beste zicht te krijgen.
Geef als antwoord de ‘F-toets’ die je gebruikt hebt.
Eiwitfunctie
De functie van een eiwit is afhankelijk van de vorm van het eiwit. Ieder eiwit heeft zijn eigen specifieke vorm. Zo kun je aan de vorm van het eiwit atrolysine (slangengif) afleiden dat het een enzym is.
Leg kort en bondig uit wat het sleutel-slotprincipe is. Maak er zonodig een tekening bij.
Als een substraat gebonden is aan een eiwit, bijvoorbeeld aan een enzym, wordt het substraat geknipt. Dit gebeurt in het actieve centrum van het eiwit. Een goede binding van het substraat aan het actieve centrum is nodig voor deze tamelijk heftige reactie. De vorm van het eiwit kan hierbij helpen.
Hoe zorgt de vorm van het eiwit ervoor dat het (juiste) substraat stevig kan worden gebonden?
Zoek het actieve centrum van het slangengif door te roteren en te zoomen. Kies de weergave die je zelf het makkelijkst vindt. Besteed niet meer dan een minuut aan je zoektocht. Als je nog niets hebt gevonden na een minuut, ga dan verder naar de volgende opdracht.
Veel eiwitten maken gebruik van een metaal-ion voor een sterke binding met het substraat. Metaalionen zijn namelijk vaak positief geladen.
Reset Yasara door File > New te kiezen en dan op Yes te klikken. Laad nu het bestand slangengif2.pdb.
In de juiste weergave is het zinkion (Zn2+) duidelijk zichtbaar. Gebruik dit ion om het actieve centrum te vinden.
Cheat: gebruik de sequentiebalk. Aan het eind van deze sequentie staat Zn van zink. Als je hier op klikt wordt het juiste atoom geselecteerd. Als je de Ctrl toets inhoudt terwijl je klikt wordt je zelfs volautomatisch naar de juiste plaats in het eiwit gebracht.
Nu het actieve centrum bekend is, kunnen we op zoek gaan naar een tegengif.
Op welke manier(en) zou je een enzym (slangengif) kunnen uitschakelen?
Bekijk het filmpje: open Help > Play help movie > 6.8 Rattle snake poison > OK. Klik op Continue als het filmpje afgelopen is. Je kunt het molecuul nog even bekijken. Sluit het venster (en klik op Yes) om terug te gaan naar het hoofdvenster van Yasara.
Je ziet dat er een substraat in het actieve centrum van het gif komt en aan het eiwit bindt. Dit substraat is zó gemaakt dat het precies in het eiwit past. De oranje atomen zijn echter nog niet ingevuld voor de goede atomen.
Bekijk de versies van het tegengif en let op mogelijke waterstofbruggen en ionogene interacties die de verschillende atomen in het substraat met het slangengif zouden kunnen aangaan. Markeer op je antwoordblad de atomen die interacties kunnen aangaan.
Bekijk nu de versies van het tegengif in Yasara.
Open de moleculen via File > Load > Complete scene. Kies het bestand ligand_version1.sce. Je ziet het substraat in de ball and stick weergave. Het slangengif is weergegeven als cartoon met de aminozuren dicht bij het substraat in de stickweergave.
Als je ligand_version1.sce hebt bekeken, herhaal dat dan voor ligand_version2.sce en ligand_version3.sce. Noteer je bevindingen op het antwoordvel.
Welk substraat zou jij als tegengif gebruiken? Leg uit waarom.
Je bent nu aan het einde gekomen van dit practicum.
Zou je het evaluatieformulier willen invullen? Zo kunnen we het practicum in de toekomst nog leuker maken en bovendien maak je kans om een Radboud Hoodie te winnen!