Practicum Zien en zicht verliezen

Opdracht 1

Patiënten met RP hebben beschadigde staafjes in hun ogen. De kegeltjes zijn in eerste instantie nog helemaal intact. Hoe kunnen beschadigde staafjes ervoor zorgen dat patiënten ’s nachts heel slecht kunnen zien?

Marjolein en Mark vragen hulp aan geneticus dr. Van Steveninck. Dokter van Steveninck weet te vertellen dat Retinitis Pigmentosa vaak wordt veroorzaakt door een mutatie in het gen van rodopsine. Rodopsine is een klein eiwit dat in het membraan van het lichtgevoelige gedeelte van een staafje-cel in het oog zit.

Opdracht 2
 

A. Waar in onderstaande afbeelding van een oog zitten de staafjes-cellen?

B. Waar in onderstaande afbeelding van een staafje-cel zitten de rodopsine-eiwitten?

volgende opdracht ->

Inmiddels weet je dat Retinitis Pigmentosa vaak wordt veroorzaakt door een mutatie in het gen van rodopsine. In een online databank kan de basenvolgorde van het mRNA van rodopsine worden opgezocht. Die ziet er zo uit:

>GezondRodopsine
augaauggcacagaaggcccuaacuucuacgugcccuucuccaaugcgacggguguggua
cgcagccccuucgaguacccacaguacuaccuggcugagccauggcaguucuccaugcug
gccgccuacauguuucugcugaucgugcugggcuuccccaucaacuuccucacgcucuac
gucaccguccagcacaagaagcugcgcacgccucucaacuacauccugcucaaccuagcc
guggcugaccucuucaugguccuagguggcuucaccagcacccucuacaccucucugcau
ggauacuucgucuucgggcccacaggaugcaauuuggagggcuucuuugccacccugggc
ggugaaauugcccugugguccuuggugguccuggccaucgagcgguacgugguggugugu
aagcccaugagcaacuuccgcuucggggagaaccaugccaucaugggcguugccuucacc
ugggucauggcgcuggccugcgccgcacccccacucgccggcugguccagguacaucccc
gagggccugcagugcucguguggaaucgacuacuacacgcucaagccggaggucaacaac
gagucuuuugucaucuacauguucgugguccacuucaccauccccaugauuaucaucuuu
uucugcuaugggcagcucgucuucaccgucaaggaggccgcugcccagcagcaggaguca
gccaccacacagaaggcagagaaggaggucacccgcauggucaucaucauggucaucgcu
uuccugaucugcugggugcccuacgccagcguggcauucuacaucuucacccaccagggc
uccaacuucggucccaucuucaugaccaucccagcguucuuugccaagagcgccgccauc
uacaacccugucaucuauaucaugaugaacaagcaguuccggaacugcaugcucaccacc
aucugcugcggcaagaacccacugggugacgaugaggccucugcuaccguguccaagacg
gagacgagccagguggccccggccuaa

De volgorde bestaat uit 1047 basen.

Dokter van Steveninck wil het genetische materiaal van het ongeboren kindje van Mark en Marjolein vergelijken met gezond genetisch materiaal. Met moderne apparatuur analyseert hij het mRNA van het kindje. Hierbij heeft hij vooral aandacht voor de mRNA volgorde van het rodopsinegen.

De basenvolgorde van het mRNA van rodopsine van het kindje ziet er zo uit:

>Rodopsinebaby
augaauggcacagaaggcccuaacuucuacgugcccuucuccaaugcgacggguguggua
cgcagccccuucgaguacccacaguacuaccuggcugagccauggcaguucuccaugcug
gccgccuacauguuucugcugaucgugcugggcuuccccaucaacuuccucacgcucuac
gucaccguccagcacaagaagcugcgcacgccucucaacuacauccugcucaaucuagcc
guggcugaccucuucaugguccuagguggcuucaccagcacccucuacaccucucugcau
ggauacuucgucuucgggcccacaggaugcaauuuggagggcuucuuugccacccugggc
ggugaaauugcccugugguccuuggugguccuggccaucgagcgguacgugguggugugu
aagcccaugagcaacuuccgcuucggggagaaccaugccaucaugggcguugccuucacc
ugggucauggcgcuggccugcgccgcacccccacucgccggcugguccagguacaucccc
gagggccugcagugcccguauggaaucgacuacuacacgcucaagccggaggucaacaac
gagucuuuugucaucuacagguucgugguccacuucaccauccccaugauuaucaucuuu
uucugcuaugggcagcucgucuucaccgucaaggaggccgcugcccagcagcaggaguca
gccaccacacagaaggcagagaaggaggucacccgcauggucaucaucauggucaucgcu
uuccugaucugcugggugcccuacgccagcguggcauucuacaucuucacccaccagggc
uccaacuucggucccaucuucaugaccaucccagaguucuuugccgagagcgccgccauc
uacaacccugucaucuauaucaugaugaacaagcaguuccggaacugcaugcucaccacc
aucugcugcggcaagaacccacugggugacgaugaggccucugcuacaguguccaagacg
gagacgagccagguggccccggccuaa

Ook deze volgorde bestaat uit 1047 basen.

Opdracht 4
 

A. Deze volgordes van basen coderen beiden voor het eiwit rodopsine. Zijn dit DNA- of mRNA-volgordes? Waaraan kun je dat zien?
 

B. Waarvoor codeert het eerste codon? En het laatste? Gebruik hiervoor de codontabel.

<- vorige opdracht                                   volgende opdracht -> 

Mutaties in het rodopsinegen

Met het blote oog kun je niet makkelijk zien of er verschillen zijn tussen het normale rodopsinegen en het rodopsinegen van het kindje. Met behulp van de computer kun je eenvoudig de basenvolgordes met elkaar vergelijken. Dit heet alignen. In de bioinformatica wordt hiervoor vaak het programma ClustalOmega gebruikt.

In bovenstaande afbeelding staat een schematische weergave van een alignment. De basenvolgordes van twee stukken DNA worden naast elkaar gelegd en met elkaar vergeleken. Onderdelen die verschillen van elkaar zijn rood gekleurd.

Volg onderstaande stappen:

1. Ga naar de website van EMBL-EBI.

2. Alle instellingen op de website mag je gewoon laten staan. Het enige gedeelte dat we gebruiken is het invoerveld. Kopieer beide genen (titel + basenvolgorde) na elkaar, zonder witregel, in het invoerveld. Klik hieronder de genen open.

3. Klik op submit en wacht tot het programma resultaten kan laten zien. Let op: dit kan even duren.

De resultaten openen in dezelfde pagina. Klik op ‘Show Colors’.

Opdracht 5

Onder Alignment staan steeds 3 regels. De eerste regel geeft het ingevoerde RNA van het normale rodopsinegen. De tweede regel geeft het ingevoerde RNA van het rodopsinegen van het kindje. De derde regel toont de verschillen en gelijkenissen tussen de RNA codes. Een sterretje betekent dat de basen gelijk zijn. Als de basen verschillen, staat er geen sterretje.

A. Hoeveel verschillen kun je vinden tussen de twee basenvolgordes?
 

B. Zoek het tweede(!) verschil op. Wat is het codon van het gezonde rodopsinegen? En wat is het codon van het kindje? (NB: iedere regel start met een nieuw codon)
 

C. Voor welk aminozuur codeert dit codon in het normale rodopsinegen? Gebruik hiervoor de codontabel
 

D. Voor welk aminozuur codeert dit codon in het rodopsinegen van het kind? Gebruik hiervoor de codontabel
 

E. De andere verschillen in de RNA codes staan in een tabel op je antwoordenblad. Zoek bij iedere verandering de gemuteerde base en het veranderde aminozuur op. Gebruik hiervoor de codontabel. Een aantal antwoorden zijn al gegeven.

Opdracht 6
 

A. Onder aan de alignment kun je zien dat het gezonde rodopsinegen en dat van het kindje uit 1047 basen bestaat. Drie basen coderen voor 1 aminozuur. Uit hoeveel aminozuren bestaat het eiwit rodopsine?
 

B. Het hoeveelste aminozuur is veranderd bij de eerste mutatie? Vul dit antwoord in de tabel van opdracht 5.
 

C. Maak de rest van de tabel compleet. Deze complete tabel hebben we zo nodig bij het doorvoeren van de mutaties in 3D-software.

<- vorige opdracht                                   volgende opdracht -> 

Rodopsine beter bekeken

Het programma Yasara kan 3D structuren goed weergeven. Als Yasara nog niet op de computer is geïnstalleerd, kun je dat aan een student vragen.

Volg onderstaande stappen:

1. Start Yasara.

2. Laad rodopsine via het menu aan de linkerbovenkant van het venster: File > Load > PDB file. Kies het bestand rhodopsin.pdb en klik op OK.

3. Als je de muisaanwijzer in het onderste gedeelte van het Yasarascherm houdt, verschijnt de zogenaamde sequentiebalk. Hierin staan de aminozuren van het eiwit. Met de knop in de linkerbovenhoek van de balk (die er uitziet als een blauwe punaise) zet je de sequentiebalk vast.

4. Als je op een aminozuur in de sequentiebalk klikt, gaat het centrale C-atoom van dat aminozuur knipperen. Als je de Ctrl-toets inhoudt terwijl je klikt word je automatisch naar de juiste plaats in het eiwit gebracht.

5. Met de muis kun je het eiwit bewegen door de muisknop in te houden:

Links: Roteren
Midden: Verplaatsen
Rechts: Zoomen

Opdracht 7
 

A. Welke elementen uit het periodiek systeem geven de gekleurde bolletjes (groen, blauw, rood etc.) weer?

Druk op F6. Het eiwit wordt nu op een andere manier weergegeven. De helices (helix = vorm van wenteltrap) die je nu ziet zijn bijzondere eiwitstructuren. In dit eiwit zorgen zij voor de hechting in het membraan. Tussen de helices zit een klein molecuul: retinal.

Retinal verandert van vorm onder invloed van licht. Inactief retinal (kromme structuur) geeft geen signaal door aan de hersenen. Actief retinal (rechtere structuur) geeft wel een signaal door aan de hersenen.

B. Is retinal in het 3D-eiwit in Yasara actief of inactief?

<- vorige opdracht                                   volgende opdracht -> 

Mutaties in rodopsine

Wanneer een aminozuur verandert, hoeft dat niet meteen te betekenen dat het eiwit zijn functie kwijt is. Om te bepalen wanneer een mutatie in een eiwit ècht schadelijk is, onderzoeken wetenschappers de 3D-structuur (tertiaire structuur) van een eiwit.

Om goed de verschillende plekken van de mutaties te zien, kunnen alle andere plekken wit worden gekleurd. Deze weergave van rhodopsine kun je openen in Yasara:

Kies New. Kies dan File > Load > YASARA scene. Kies het bestand rhodopsin.sce en klik op OK.

Je ziet nu drie kleuren:

• Oranje: In het midden zie je de oranje retinalgroep.
• Groen: Retinal is gebonden aan rodopsine via het aminozuur lysine 296, deze is groen gekleurd.
• Blauw: De aminozuren die bij het kindje van Mark en Marjolein gemuteerd zijn, zijn blauw gekleurd.

Nu gaan we mutatie 6 uit de tabel van opdracht 4 aanbrengen in het eiwit:

1. Kies in de aminozuurbalk onderaan het aminozuur Lys op plek 296. Een atoom (één bolletje) begint nu te knipperen. Je ziet dat dit aminozuur retinal verbindt met het rodopsine eiwit.

2. Klik met de rechtermuisknop op het knipperende atoom van het aminozuur in het eiwit. Kies Swap > Residue (vervang > aminozuur). Kies uit de lijst het aminozuur Glu.

3. Het nieuwe aminozuur is niet meteen goed zichtbaar. Klik daarvoor weer met de rechtermuisknop op het aminozuur en kies Show atoms > Residue sidechain & CA. De verandering in het aminozuur wordt aangegeven met stokjes. Je ziet dat het aminozuur retinal niet meer bindt met het rodopsine eiwit. Hierdoor kan het retinal via het rodopsine eiwit geen signaal meer doorgeven aan de hersenen.

Opdracht 8
 

A. Bekijk mutatie 1 in de tabel van opdracht 4. Leg uit dat deze mutatie geen verschil geeft in het eiwit. Natuurlijk geldt dit ook voor mutatie 7.
 

B. Voer mutatie 2, 3, 4 en 5 door in rhodopsine in Yasara. Doe dit op soortgelijke wijze als mutatie 6 (Lys wordt op plek 296 Glu).
 

C. Alleen bij activatie van retinal geeft het eiwit een signaal door aan de hersenen. Als er licht in je oog valt, wordt retinal geactiveerd en strekt het uit. Hiervoor heeft retinal ruimte nodig. Welke mutaties belemmeren de activatie van retinal?
 

D. Actief retinal kan alleen een signal geven aan de hersenen als het is verbonden aan het rodopsine. Welke mutatie(s) belemmeren de aanhechting van het retinal aan rodopsine?
 

E. Heeft het ongeboren kindje van Mark en Marjolein Retinitis Pigmentosa? Leg uit aan de hand van de mutaties.

<- vorige opdracht

Tot slot

Je bent nu aan het einde gekomen van dit practicum.

Zou je het evaluatieformulier willen invullen? Zo kunnen we het practicum in de toekomst nog leuker maken en bovendien maak jij kans om een Radboud Hoodie te winnen!